An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Зразок, який використовувався для демонстрації показує оптимальні настройки для вимірювання з чутливістю 85%, до максимального нахилу кривої чутливості (рис 2). Яскравість, хв / макс значення були обрані відповідно до рекомендацій в протоколі. Концентрація 5,3 частинок / мл × 10 6 була виміряна, в той час як середній розмір частинок був 0,149 мкм, більшість з них були 0,137 мкм.

Значення, отримані після вимірювання можуть бути збережені в звіті в форматі файлу .pdf або як .txt для експорту в базу даних. Графік можна регулювати як кращий, як описано в протоколі (розділ 4). Відеопослідовність також зберігається і може бути використаний для подальшого офф-лайн повторного аналізу. Проте, при такому аналізі офф-лайн, настройки попередньо придбання камери не можуть бути змінені ретроспективно.

Для того, щоб знайти оптимальні настройки параметрів для вимірювання ми опишемо тут тисе оптимізація налаштувань приладу на прикладі стандартного розміру полістирол 100 нм. Вплив двох параметрів, чутливості і хв / макс розміру на відеозображення і розподіл розмірів частинок обговорюється в деталях. Всі інші параметри наведені в таблиці 1.

Візуальне враження про вплив чутливості (від 50 до 94) на аналогових і цифрових зображень візуалізується на малюнку 3. Кількісне інформація, отримана із зображень представлена на малюнку 4, відповідно до настройками в таблиці 1, Мінімум = 5 і Максимальний розмір = 200 . Типовий відношення числа реєстрованих частинок проти чутливості показано на фіг.4. Між 50 і 90, кількість виявлених часток збільшується з чутливістю і різко виросли чутливості> 90. Оптимальний діапазон чутливості було виявлено між 66 і 86 (A). Розподіл обсягів частинок отримані з DIFНастройкі чутливості особистих показані на рис 4В. Розподіл розміру частинок є середнє з трьох окремих вимірювань. Для надто низьку чутливість (чутливість = 62, червона крива) були проаналізовані тільки кілька частинок, в результаті чого небагатих статистики. Число аналізованих частинок збільшується з чутливістю і досягли оптимуму між 70 (жовта крива) і 86 (TAN кривої). Крім того збільшив розрив у рахунку чутливості до погіршення розподілу часток за розмірами з числом частинок знижується і розподіл за розмірами людей в сторону менших розмірів (чутливість = 94, синя крива). На малюнку 4в тенденція основі діаметра номер x50 (50% частки менше, ніж цей діаметр) як функції чутливості. У бежевому інтервалу, RSD розміру часток менше 8% і відповідає оптимальний інтервал в А. Червоні області вказують RSD> 8% в результаті слабкої статистики (чутливість занадто низька) або широкої DISTRIпределенія зі зрушенням в бік менших розмірів (чутливість занадто висока).

Налаштування Мінімум і максимальний розмір фільтри, що застосовуються до цифрових зображень з метою видалення частинок з спот, розмір яких менше, ніж Мінімум і більше, ніж максимальний розмір. Через здатність розсіювати світло, частка створює пляму певного розміру на цифровому зображенні. Розмір плями вимірюється як кількість пікселів (ПВ). Коли частка розсіює світло дуже добре (наприклад, частки> 200 нм або агрегатів), розмір плями досить велика, наприклад,> 500 пікс. Розмір плями дуже мала (наприклад, <10 пікселів) для малих частинок (наприклад, <20 нм) в залежності від матеріалу частинок. Розмір плями (ПВ), не можуть бути взаємозамінними з розміром частинок (нм), оскільки вони не є ідентичними, і немає прямого зв'язку між цими двома змінними. Оптимізація хв і максимальний розмір дозволяє користувачеві відфільтрувати небажані об'єкти, такі як агломератів (максимальний розмір) і маленькіхоб'екти, такі як фоновий шум (Мінімум). Вплив Мін / Макс Розмір по розподілу часток за розмірами стандартного розміру 100 нм показана на рис 4D (чутливість = 82). Коли інтервал встановлений на малих розмірах плями (наприклад, не менше = 1, макс = 52; помаранчевий крива), число аналізованих частинок зменшується, і на основі діаметр кількість x50 злегка зміщена в бік менших розмірів. Установка для великих плям (хв = 40, макс = 1000; червона лінія) призводить до широкого розподілу часток за розмірами зміщується в бік більших розмірів. Для того щоб отримати рівні сумарні кількості частинок, межі інтервалу обох помаранчевий і червоний розподілів були скориговані, щоб відповідати 80 частинок. Розподіл з оптимальними настройками (хв = 5, макс = 200; загар крива) складається з 360 частинок.

Ряд успішних експериментів проводилися з екзосом ізольованих ультрацентрифугирование і виміряних НТА використанням представленої системи. Отримані дані були високопоследовательним і підтвердили високий рівень відтворюваності. Інші методи ізоляції повинно показати аналогічні результати. Проте, крок розведення був ідентифікований як особливо важливий крок, і його вплив на розрахункових загального числа частинок повинен бути переглянуті.

Малюнок 1. Схема установки НТА. Мікроскоп / відео і віссю лазерного променя орієнтовані ортогонально один до одного, перетинаючи в поперечному перерізі каналу клітин. Світло розсіюється частками відображається у вікні "живий погляд» програмного забезпечення. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.

Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.

Малюнок 3. Вплив чутливості на аналогові і цифрові зображення. Візуалізація частинок на екрані перегляду в реальному часі відображається чутливості між 50 і 94 для аналогового (верхній ряд) апD Digital (нижній ряд) переглядів. Якщо чутливість занадто низька, тільки кілька частинок виявлено (зліва). При оптимальної чутливості частки з'являються як окремі точки і ізольовані один від одного (в середині). На порівняно високому частки чутливості зливаються призводить до поганої якості зображення (праворуч). Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.

Малюнок 4. Вплив чутливості хв і макс настройках розмір для контрольного зразка 100 нм полістиролу частинок () Земельний чутливістю в порівнянні виявленого числа частинок .; оптимальний інтервал становить від 66 до 86, до максимального нахилу кривої. Розподілу (B) розмір часток, отримані з декількома налаштуваннями чутливості (від 62 до 94); Графіки на занадто низьке (62) або занадто висока (94) чутливості не відображають розподіл часток за розмірами для 100 нм контрольного зразка полістиролу. (C) Кількість заснована діаметр x50 в порівнянні з чутливістю; помилка x50 в бежевому інтервалі менш ніж на 8%, оптимальний інтервал становить від 66 до 86. (D) вплив хв і максимальний розмір на розподіл часток за розмірами; Оптимальні параметри (хв = 5 і Max = 200) захоплення правильний розподіл для контрольного зразка. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.

Параметри до придбання

Чутливість змінна Затвор 40 Частота кадрів 30 кадрів в секунду Дозвіл ПріветGH Цикли 10 Кілька поглинання 3 Позиція 1 Параметри після придбання Мінімальна яскравість 30 Максимальний розмір змінна Мінімум змінна

Таблиця 1. Резюме до і після придбання параметрів для налаштування відстеження частинок інструменту.